勞瑞設計并完成的下一個實驗更加細致地考察了小鼠在生命早期攝入抗生素（我們選擇用青霉素作為代表）之后發生了什么。在周義盛的實驗里，動物在斷奶之后才接觸藥物，差不多是出生之后的第24天，這相當于人類的12個多月大。現在，勞瑞在小鼠媽媽懷孕的時候就喂給它們抗生素。因此，它們體內的微生物.包括陰道里的微生物，從一開始就改變了。新生的小鼠自出生的那一刻起接觸的就是改變了的微生物群系，而且它們出生之后我們繼續給它們服用抗生素。如我們所預測的那樣，這些在出生時就接觸了抗生素的小鼠比第24天才接觸的長得更大。這套實驗步驟成了我們進行下一步實驗的標準流程。
       勞瑞進行了下一步的實驗，專門研究小鼠在什么時候開始變胖。我們知道小鼠出生之后就開始迅速生長。它們是從幼年起就開始不斷增重呢，還是要過一段時間？實驗結果表明，在雄性小鼠里，實驗組與對照組的差別從第16周開始明顯，而在雌性小鼠里，要等到第20周（對小鼠來說，這已是中年）。但是無論對于雄性還是雌性，一旦體重增加，多出來的脂肪就會保持一輩子。
       隨后，勞瑞研究了在這些年幼的小鼠體內哪些細菌更為普遍。在第4周，對照組的小鼠體內主要是乳酸桿菌，這是從母親的陰道里接種來的。這并不奇怪，因為在這個階段，它們剛剛斷奶，無論對于小鼠還是人，在這個時期乳酸桿菌都占了大多數。
但是在亞臨床劑量抗生素處理組里，大多數乳酸桿菌都不見了，取而代之的是其他類型的細菌。既然身體組成的變化在16周之后才出現，而寄生的微生物從第4周就已經出現差異，我們做出了一個重要的觀察：微生物群系的變化早于身體組成的變化。
       我長期的同事與朋友杰夫?戈登（Jeff Gordon）在華盛頓大學圣路易斯分校做了許多出色的工作，這些工作也為我們的發現提供了新的洞見。杰夫是微生物群系研究領域的泰斗，多年來集中研究腸道的發育與功能。杰夫的研究團隊利用的是一種缺失了瘦蛋白基因的小鼠（被稱為ob/ob小鼠）。這些小鼠無法合成瘦蛋白激素（瘦蛋白激素在正常小鼠體內的功能是調控食欲與飲食，并幫助大腦決定該儲存還是使用能量），所以都變得特別肥胖。杰夫和他的研究團隊求證的第一個問題是，ob/ob小鼠與它們正常的兄弟姐妹相比，體內的微生物組成是否不同。回答是肯定的，每種類型的小鼠有著獨特的腸道微生物群系。
       他們求證的第二個問題是，這些微生物是否執行了不同的代謝功能。他將肥胖的ob/ob小鼠和正常小鼠體內的腸道微生物分別接種到了無菌小鼠里。在接種前，這些無菌小鼠的腸壁更細，細胞更少，而且體重增長也較慢。但是當無菌小鼠重新獲得了腸道微生物之后，它們的長勢如何呢？杰夫的發現引起了全世界的關注：接種了肥胖小鼠的腸道微生物之后，無菌小鼠的體重開始增加，而且比對照組小鼠體重增加的速度更快。
       不過，仍有一些事需要考慮：杰夫的實驗中使用的小鼠本來就具有遺傳缺陷，它們從一開始就容易肥胖。這是肥胖的首要原因，微生物群系的變化只是次要原因。雖然杰夫的研究團隊優美地刻畫了肥胖對微生物群系及其功能的影響，但我認為，他們并沒有觸及肥胖的根本原因。此外，無菌小鼠固然為檢測關于免疫與代謝的特定假說提供了良好的系統平臺,但是它們是完全人為制造的。不過，雖然沒有天然的無菌小鼠，我們依然學到了微生物與宿主之間相互作用的許多基本原理。
       在我看來，抗生素對早期微生物群系的干擾可能是正常個體中宿主代謝發生改變的主要原因（兩年之后，我們才有了更確切的證據）。
       接下來，我們要考察的問題是，如果將亞臨床劑量抗生素處理小鼠與高脂肪的飲食結合起來，將會發生什么。眾所周知，孩子們的飲食在過去幾十年里變得越來越豐富——無論是含糖飲料，還是高脂肪食物，所含能量越來越高。今天的兒童比一兩代人以前的兒童平均攝入的能量要高得多。我們知道，小鼠攝入高能量飲食時會變得更胖，那么，亞臨床劑量抗生素處理對于高脂肪的飲食有什么影響，是增加、減緩抑或沒有作用呢？
      勞瑞將這組實驗命名為“高脂食物+亞臨床劑量抗生素處理”（FaiSTAT）,實驗結果再次讓我們為之一振。如我們所預期的那樣，高脂食物喂養的小鼠比普通食物喂養的要更胖，但是添加了抗生素依然引起了顯著的改變。我們成功地模仿了現代農場里喂養動物的做法。當抗生素與高熱量食物組合起來，雄性的體重較僅食用高脂食物的小鼠增加了10%,肌肉與脂肪的含量都有增加。但是最令人震驚的區別在于脂肪含量——雄性當中增加了 25%,雌性當中增加了100%。僅攝入了高脂食物的雌性增加了大約5克的脂肪，而接受了雙重處理（高脂食物及抗生素）的雌性增加了 10 克的脂肪，多了一倍。這個量不容小覷，尤其是考慮到小鼠的體重只有20?30克。
       因此，抗生素起了作用，高脂食物也起了作用，但是當 二者加起來，作用卻不只是疊加，而是協同作用(synergis?tic), 即1 + 1>2。對雌性小鼠，接觸抗生素開啟了一個開關，將食物中多余的能量轉換成脂肪；而在雄性里，則同時轉換成了脂肪與肌肉。我們還不知道造成性別差異的原因。盡管如此，這些觀察與下述理論吻合：現代的高熱量食物本身并不足以解釋蔓延的肥胖癥，抗生素的使用也起了推波助瀾的作用。
       接下來我們探究的是一個簡單的問題，這要歸功于勞瑞的論文委員會的建議。截至目前，實驗動物的一生都維持著亞臨床劑量的抗生素處理。那么，只持續幾周的抗生素處理是否仍然足以帶來長期性的體重增加？對于我們孩子的未來，這是一個極為重要的問題。如果只有終生接受抗生素治療才能引起體重的增加，這可能與我們的孩子沒太大關系，一輩子都服用抗生素的人畢竟極少。但是如果短期接觸抗生素就足以引發肥胖，那么這與我們的現實生活就更相關，也就可能解釋當前蔓延的肥胖癥。大多數兒童在耳部或者呼吸道感染的時候，都曾短暫接觸過抗生素。2011年3月，勞瑞開始了“亞臨床劑量抗生素處理的持久性”(DuraSTAT)實驗。之所以如此命名是因為我們檢測的是短時間的抗生素接觸是否會引起增重的效果、效果有多持久。她將小鼠分為4組：沒有抗生素處理的，作為對照組；亞臨床劑量抗生素處理4周，然后停止；亞臨床劑量抗生素處理8周，然后停止；最后一組是亞臨床劑量抗生素處理持續整個實驗周期。所有的小鼠都在第6周進食高脂食物，以觀察區別。鑒于我們之前“高脂食物+亞臨床劑量抗生素處理”的實驗結果，勞瑞將研究集中于雌性小鼠。
       不出所料，在整個實驗周期一直接觸抗生素的小鼠比起對照組的體重有所增加。但是接觸了4周或8周的抗生素與接觸了 28周的抗生素引起的效果一樣。與對照組相比，攝入了青霉素的小鼠體重增加了10%?15%,脂肪含量增加了 30%?60%。換句話說，生命早期接觸亞臨床劑量抗生素處理足以帶來終生的影響，小鼠的發育過程改變了。亞臨床劑量抗生素處理持久性實驗的結果并不完全等同于高脂食物+亞臨床劑量抗生素處理的結果，它們的實驗條件也不一致。因此無法直接比較兩者——有效的比較只能在各個實驗之內進行。在科學探索中，這是一個重要的問題。有些同行陷入了 “不當比較”的誤區——如果某些沒有考慮到的條件改變了，這樣的比較就是沒有意義的。但是對我們來說，兩組試驗得出了完全一樣的趨勢：早期接受了亞臨床劑量抗生素處理的小鼠的發育過程被永久性地改變了。
接下來我們決定研究微生物群系本身。勞瑞無比認真地收集了細小的糞樣——每只小鼠，一天一次。她已經收集了幾千支玻璃試管，按每盒100只裝進白色盒子里。每支試管都是一次樣品，需要大約2萬支試管才夠0.5千克。由于它們攜帶的信息里隱藏的秘密，這比同等質量的黃金還要珍貴。
勞瑞對數百個樣品進行了測序分析，推斷其中的DNA 組成，并了解微生物群系的組成結構（再次借用警察與教師的比例這個比方，不過這一次我們研究得更為細致），比如稅務律師、出租車司機、動物標本制備師等所占的比例。
       她首先關注的是剛剛斷奶的3周大的小鼠，對接受了青霉素的處理組與沒有接受抗生素的對照組進行了比較。雖然兩組的微生物群系在結構上有部分重合，但它們是截然可分的。這正是我們所預期的：抗生素改變了腸道內的微生物群系結構。
       然后她研究的是從8周大的小鼠身上取得的糞樣。現在我們有了三組不同的小鼠：對照組（未經抗生素處理）小鼠、在第4周就停止了攝入抗生素的小鼠、連續8周一直在攝入抗生素的小鼠。如我們預期的那樣，接受了8周抗生素的小鼠與對照組相比，體內的微生物群系結構差異比它們3 周時的更大。抗生素確實是有效的。但是在第4周就停用了抗生素的小鼠與對照組相比，幾乎沒有什么區別——它們幾乎完全重合。這意味著4周的抗生素使用對微生物群系結構的影響是暫時性的。結果非常清楚。但是，別忘了，這些小鼠增加的脂肪與連續8周攝入抗生素的小鼠增加的脂肪一樣多。這暗示著，生命早期短暫接觸過抗生素可以干擾體內微生物的組成，而且，即使這種干擾本身是暫時的，它們的后果卻是終生性的。
       這是一項重大發現。我相信，我們孩子身上發生的正是這種情況。在小鼠身上，在關鍵的早期階段對微生物的干擾足以改變宿主的發育過程。正是這個實驗說服了我抗生素有可能改變了發育過程。當然，發育是一個多維度的事件：它既有代謝的一面，如我們的小鼠實驗所揭示的這樣，也有免疫、認知能力的方面。隨著嬰兒的成長，即使是在他們睡眠過程中，他們體內的微生物群系也在塑造著他們后期發育的基礎。在發育的關鍵階段，即使是暫時的感染也會帶來巨大的改變。
但是作為科學家，我們需要不斷拓展理論，了解更多細節，發現運行的機理。我們需要回答這個看似簡單的問題：它是怎么工作的？為什么早期接觸了抗生素如此重要？這是由于它對微生物的作用，還是因為青霉素有其他方面的效果，比如直接與小鼠的身體組織作用，與微生物卻毫無關系？如同許多之前所做的實驗，包括杰夫-戈登課題組的工作，我們將要嘗試著在小鼠之間移植微生物來回答這些問題。
       回憶一下我們之前的問題：體重的增加是由于抗生素的直接作用呢，還是由于抗生素影響了體內寄居的微生物？我們假定這是由于微生物，但是假定不等于證明。為了回答該問題，我們需要做的是將亞臨床劑量抗生素處理過的小鼠或者對照組小鼠體內的微生物轉移到中性條件下，然后觀察受體小鼠的反應是否有區別。如同杰夫，我們選擇以無菌小鼠作為這個中性條件來進行研究。
       我們購買了 15只無菌雌性小鼠，2011年8月下旬它們抵達了我們的實驗室，裝在三個大塑料囊里，各有5只。它們3周大，剛剛斷奶。提供小鼠的公司告訴我們，這些小鼠可以在這種大塑料囊里維持無菌狀態達72個小時，這足夠我們開始實驗了。我們稱之為“移植亞臨床劑量抗生素處理實驗”(TransSTAT),這是因為我們將把亞臨床劑量抗生素處理過的小鼠體內的微生物群系轉移到受體小鼠里。
       勞瑞從她的亞臨床劑量抗生素處理持久性的實驗里選擇了 6只18周大的小鼠：3只作為對照組，另外3只持續攝入抗生素。她從每只小鼠身上都采集了盲腸樣品，分成兩組: 一個是對照組，另外一個是亞臨床劑量抗生素處理組。這些盲腸樣品里有些微生物對氧氣敏感，哪怕一丁點的接觸都會讓它們喪命。多虧了勞瑞扎實的細菌學訓練，這些微生物才得以存活，然后將樣品移植到每一只無菌小鼠的胃里。7只無菌小鼠接受了對照組里的糞樣，另外8只接受了亞臨床劑量抗生素處理過小鼠的糞樣。對你我而言，將糞樣引入胃里聽起來格外惡心，但是小鼠們卻有食糞癖(coprophagic) 它們經常吃自己或其他小鼠的糞便。
       現在，這些小鼠不再是無菌的了。它們被“重新接種上 了微生物”，開啟了新生活。我們繼續追蹤了 5周，定期獲取糞樣，并進行必要的測量，包括對每一只小鼠進行4次 DEXA掃描。我們沒有再對它們喂食更多的抗生素。所有的小鼠都在同等條件下喂養，它們的區別僅僅在于最初接種的微生物不同。
不出所料，在它們的生長階段，所有小鼠的體重都在增加。不過，接受了亞臨床劑量抗生素處理組微生物移植的小鼠增重更多，比對照組小鼠的脂肪含量也更高。而且這種差異相當可觀：與對照組小鼠相比，實驗組小鼠平均增重多出了10%,脂肪含量多出了40%。
       這些實驗表明，亞臨床劑量抗生素處理改變了微生物群系，進而誘導了發育的變化——而且，僅僅是移植變化之后的微生物群系本身，便可以改變受體宿主的發育過程。
網絡轉載《消失的微生物》作者馬丁?布萊澤。